Nat Rev Genet发表房刚组细菌表观组综述论文
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表观遗传学在基因调控中起到重要的作用。同样的DNA序列何以产生不同的功能。华人科学家对表遗传学的研究起到了重大的引领性的贡献。但是绝大部分的表观遗传学研究聚焦在真核生物，尤其是哺乳动物。人类基因组中最广泛的DNA甲基化在胞嘧啶（cytosine, C）上，而细菌中最常见的DNA甲基化在腺嘌呤（adenine, N6-methyladenie, 6mA）上。除此之外，细菌的基因组中还有另外两种DNA甲基化（N4-methylcytosine, 4mC; and 5-methylcytosine, 5mC）。
虽然细菌DNA甲基化在几十年前就被发现，人们对细菌DNA甲基的研究却经历了很长的技术障碍。被广泛使用的bisulfite sequencing可以很有效的检测5mC,却不能检测m6dA。2010年，第三代单分子实时测序技术（by Pacific Biosciences）的诞生使6mA的检测变成了可能【1】。2012年, 西奈山伊坎医学院（Icahn School of Medicine at Mount Sinai）房刚和团队在Nature Biotechnology上发表了第一个利用第三代单分子实时测序技术对细菌6mA表观基因组的研究【2】，并发现m6dA可以直接或间接调解调节大肠杆菌1000多个基因的转录水平。在过去的六年里，2000多种细菌的表观遗传组被破译，而且科学家们发现m6dA可以调节细菌的细胞周期，基因表达，DNA错配修复，抗生素抗药性，致病因子调控，和宿主的交互性作用。
近日，房刚课题组在Nature Reviews Genetics 上发表了一篇题为Deciphering bacterial epigenomes using modern sequencing technologies的综述详细的总结各种测序技术，尤其是第三代测序技术在细菌表观遗传组研究中的应用，以及表观遗传学在细菌基因表达和致病菌中的重要功能。
DNA甲基化在细菌中广泛的存在：一开始的发现是在细菌的先天免疫系统（Restriction-Modification, RM systems；限制修饰系统）中。大家熟悉的CRISPR/Cas9是细菌的后天免疫系统。在RM system中，细菌通过对自身基因组在特殊序列(e.g. GATC)上的甲基化修饰来区分并剪切侵入的噬菌体DNA。细菌的RM system分为三大类（图一; Types I, II and III），分别具有不同的DNA序列甲基化和剪切的识别模式。
图一：三大类细菌限制修饰系统。
早期的细菌表观遗传学研究主要基于已知的选择性内切酶(restriction enzyme)，并且发现了具体甲基化位点在基因表达中的作用。但是依靠于已知的选择性内切酶无法有效地对未知细菌表观遗传组进行解密。这一点对Type I 和 Type III 系统尤为突出，因为这两种系统的剪切位点和甲基化位点并不相同（图一）。 这一局限性在2012年被打破：房刚团队利用单分子实施测序技术（SMRT sequencing；图二 a-c）第一次解密6mA表观组【2】。
关于SMRT sequencing检测DNA甲基化的具体原理以及其在真核生物基因组中的应用注意事项，请见最近BioArt的推文（特别推荐丨单分子测序在真核生物DNA甲基化(6mA)检测中的机遇和挑战）。本篇综述对最近几年有迅速发展的另一种第三代测序技术（Oxford Nanopore sequencing牛津纳米孔测序）也进行了介绍和总结。这项技术被示例可以检测到DNA甲基化（图二，d-f），但是其在实际应用中的作用仍需进一步技术研发与详细评估。
图二: 图解SMRT sequencing（a-c）和nanopore sequencing （d-f）检测DNA修饰的基本原理。
在过去的六年里，2000多个细菌的甲基化组被解密，这些研究几乎都是基于SMRT sequencing。平均每个基因组有三个甲基化的识别序列（motif），相对应的是不同的DNA甲基化酶。也就是说，人们对于细菌甲基化酶的积累和理解在过去六年里大幅度提高（图三）。尤其是新发现的Type I 和 Type III 系统中的甲基化酶的数量和之前相比有着突破性的提高，因为这两种系统无法有效地被之前的技术检测到。而且随着这些细菌的甲基化组被解密，人们对于DNA甲基化在细菌中的重要功能有了很多新的认识。其中既包括从基础科学角度对DNA甲基化在基因表达中的调控，也包括DNA甲基化对致病菌表型的重要发现。比如说，DNA甲基化对沙门氏菌的毒性(virulence)至关重要；和脑膜炎双球菌的抗生素敏感性有着紧密联系；对肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，卡他莫拉菌在宿主的定殖和感染中起到调控作用。房刚课题组在去年末在Nature Biotechnology上发表的宏表观组的研究进一步的开启了直接（无需细胞培养）对致病菌在宿主中的调节功能的研究（华人学者开启DNA甲基化在微生物群落研究中功能性的探索丨Nat Biotech）。
图三：过去四十年新发现的的细菌甲基化酶的数量。
越来越多的细菌甲基化组被破译，而且研究者对它们在致病菌表型的调控中的作用越来越重视。可是人们对于DNA甲基化调节基因表达的机制上的了解还有很多没有解开的秘密。目前为止，人们在细菌中发现的调节机制大概分成三种：
１）一个（或少数几个）甲基化位点直接影响某个转录因子的DNA绑定，从而调控一个或少数几个基因的转录（图四ａ）；
２）一个甲基化酶由于序列的突变在不同的单细胞中呈现开／关的变化，从而影响多个基因的转录（图四ｂ）；
３）一个甲基化酶由于序列的突变在不同的单细胞中呈现出不同的识别序列，从而影响多个基因的转录（图四ｃ）；
其中后两种机制与真核生物的调节有着很大的不同。虽然这些机制在多种细菌中被发现，多个研究认为这些机制只能解释一小部分的DNA甲基化对基因转录的调控。新的未知的调控机制仍需要更多更深入的研究来发现。
图四：细菌中三种常见的甲基化对基因表达的调节方式。
DNA甲基化调控对细菌有着怎样的优势呢？目前的一个从进化生物学的角度的看法是：一个具体的细菌菌株的不同细胞之间存在多样性（图五ａ）。在各种环境或者宿主内的压力下，每个细胞的表型多样性会增加这个群体生存的机率（不同的条件下只需有一小部分细胞存活即可）从而增强这个群体的竞争优势（图五ｂ）。虽然从技术的角度，人们已经可以对DNA甲基化在不同细胞中的多样性进行分析【3】，对于机制和功能的研究仍刚刚起步。
图五：单个细菌species甲基化组的多样性有利于表型多样性，增强群体的竞争优势。
最后，综述强调第三代测序对于细菌表观遗传学的研究提供了很多新的机遇。既包括创新性技术的研发，也包括对未知的调控机制的发现。最重要的是细菌表观遗传学的深入理解有望帮助人们更有效对抗致病菌和传染性疾病。希望这篇综述能够让大家更多的了解第三代测序技术和细菌表观遗传学研究。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41576-018-0081-3
友情提示：
房刚课题组正在招聘多名博士后进行基于第三代测序的新技术开发和其在病原菌，宏基因组，真核生物基因组，在疾病研究中的应用。
课题组网页：http://research.mssm.edu/fanglab/
联系方式：fanggang@gmail.com
参考文献
1. Flusberg, B. A., Webster, D. R., Lee, J. H., Travers, K. J., Olivares, E. C., Clark, T. A., ... & Turner, S. W. (2010). Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing. Nature methods, 7(6), 461.
2. Fang, G., Munera, D., Friedman, D. I., Mandlik, A., Chao, M. C., Banerjee, O., ... & Deikus, G. (2012). Genome-wide mapping of methylated adenine residues in pathogenic Escherichia coli using single-molecule real-time sequencing. Nature biotechnology, 30(12), 1232.
3. Beaulaurier, J., Zhu, S., Deikus, G., Mogno, I., Zhang, X. S., Davis-Richardson, A., ... & Schadt, E. E. (2018). Metagenomic binning and association of plasmids with bacterial host genomes using DNA methylation. Nature biotechnology, 36(1), 61
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